广州辉骏生物科技股份有限公司

一．Pulldown的概念

       在Pulldown实验中，带标签的诱饵蛋白能被特异结合该标签的固相亲和配基捕获，形成“次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。纯化产物洗脱后，经Westernblot验证或LC-MS/MS，即可证明或鉴定与诱饵蛋白互作的蛋白。

二．Pulldown实验流程

                                                                          图1.Pulldown流程示意图

三．Pulldown实验方案设计
1、构建含His或GST标签的诱饵蛋白原核表达载体；
2、原核表达诱饵蛋白（我们采用自诱导培养基培养细菌，能有效降低包涵体的形成）；
3、细菌裂解液过柱，带标签的诱饵蛋白被固相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”；
4、待测样品裂解液过柱孵育，与诱饵蛋白互作的蛋白被“次级亲和支持物”吸附；
5、清洗，离心，去除未结合的杂蛋白；
6、洗脱，得到诱饵蛋白及其互作蛋白的复合物；
7、如要验证某蛋白X与诱饵蛋白互作，则将6.所得的蛋白复合物与X蛋白的抗体孵育，做Westernblot验证即可；
8、如要寻找诱饵蛋白可能的互作蛋白，则需将6.所得的蛋白复合物做LC-MS/MS鉴定；
图2.Pulldown实验流程图

四．生物信息学分析GO注释统计
 
                                                    
 Pathway分析

五．Pulldown实验技术服务内容
1、原核表达载体构建；
2、融合蛋白的诱导表达与纯化；
3、pulldown捕获互作蛋白；
4、Westernblot验证或LC-MS/MS鉴定互作蛋白；
5、数据检索、生物信息学分析；
6、结果分析与报告整理。